用辣根過氧化物酶標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接檢測的實驗步驟

（1）將蓋玻片、載玻片或培養(yǎng)板置于水平面上；如為1h或1h以下的短程孵育，則勿需濕孵，可將蓋玻片或載玻片直接放置在實驗臺上。多個蓋玻片則需置于Parafilm膜上，因為Parafilm膜有彈性，能夠防止抗體溢出蓋玻片邊緣，也便于鑷子操作。但如果圓形蓋玻片數(shù)量過多，將其置于細(xì)胞生長與固定的24孔培養(yǎng)板中。
如果孵育時間>1h，則需將其置于培養(yǎng)皿或濕盒中以利濕孵。有幾種方法可供放置蓋玻片或載玻片選用，以便于操作和濕孵，可依具體情況選用。例如，在培養(yǎng)皿上鋪一層水飽和的濾紙，再將載玻片置于濾紙上。蓋玻片亦可經(jīng)類似處理。如用24孔培養(yǎng)板，則需在板蓋上鋪一層潮濕的濾紙來保持濕度。
如孵育時間超過1h，可將抗體溶液加在Parafilm膜上的玻片上，再將蓋玻片或載玻片（樣品面朝-F）蓋在抗體溶液上。孵育完畢后用PBS洗滌。 用辣根過氧化物酶標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接檢測的實驗步驟

左為用蓋玻片在石蠟?zāi)ど喜僮饔覟樵?4孔板中操作
（2）加入一抗：加入足夠量的一抗使其覆蓋細(xì)胞，但不要溢出蓋玻片或載玻片邊緣，通常加入iotA。所有稀釋液必須用蛋白質(zhì)溶液配置，如3％BSA／PBS；
單克隆抗體通常為組織培養(yǎng)上清液（特異性抗體濃度為20～50ug／m1，未稀釋）。腹水、純化的單克隆和多克隆抗體以及粗制的多克隆血清應(yīng)該進(jìn)行稀釋度測定。如果特異性抗體的濃度是未知的，應(yīng)測試初始樣品的不同稀釋度（1：10，1：100，1：1 000，1：10 000）。
（3）蓋玻片、載玻片或平皿的孵育，在室溫下至少30 min。超過30 min則需濕孵或采用步驟（1）所述的方法。對于某些反應(yīng)，將孵育時間延長至12h，能夠提高實驗的靈敏度；
（4）PBS洗3次，每次5min以上；用辣根過氧化物酶標(biāo)記的試劑進(jìn)行間接檢測的實驗步驟
PBS緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以幫助解決背景問題。
（5）加入HRP標(biāo)記的抗Ig抗體。這些試劑應(yīng)購于有良好信譽的商業(yè)試劑公司。確認(rèn)所選擇的二抗是特異性針對一抗的種屬來源。例如，一抗如果來源于兔，則羊抗兔Ig將是一個很好的選擇。二抗應(yīng)該用含蛋白質(zhì)的溶液（如3％BSA／PBS）進(jìn)行稀釋。供應(yīng)商會建議合適的稀釋度，但如果沒有相關(guān)建議，可進(jìn)行二抗稀釋度測定，稀釋度范圍在1：10和1：1 000之間。
加入稀釋液的競爭蛋白必須為非特異性抗體，其來源應(yīng)與標(biāo)記二抗一致，即同一種屬的動物。例如，如果使用標(biāo)記的羊抗兔Ig，則稀釋液中須含1％的非免疫羊18（從非免疫動物中分離及純化）。
（6）加入標(biāo)記的二級試劑后在室溫下孵育至少20min，但不應(yīng)超過1h；
（7）用PBS洗3次，每次5min以上。
（8）zui后一次洗滌時，準(zhǔn)備底物DAB。將6mgDAB溶于10ml 0．5mol／LTris緩沖液中（pH 7．6），加lml 0．3％W／V的氯化鎳儲存液（或等量的氯化鈷）；
加0．1ml的3％H202溶液。30％H202溶液較易獲得，可置4℃保存1個月；
如出現(xiàn)沉淀，用Whatman 1#濾紙（或類似濾紙）過濾；
（9）將底物溶液加入樣品。觀察樣品，在背景發(fā)生變化前出現(xiàn)適量黑色沉淀時終止反應(yīng)。常為1～20min之間。在水中漂洗數(shù)次即可終止反應(yīng)
（10）加入DPX，用光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果。