多肽合成的原理及應(yīng)用
2009-08-24
[5862]
多肽是一種與生物體內(nèi)各種細胞功能都相關(guān)的生物活性物質(zhì)，它的分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成的化合物。到現(xiàn)在，人們已在人體中發(fā)現(xiàn)和分離出一百多種肽類，關(guān)于多肽的研究與應(yīng)用，也取得了巨大的進步，引發(fā)了的研究熱潮。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應(yīng)用價值，多肽研究成為了醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究的重點對象，世界各先進國家無不撥出巨款來建立各種規(guī)模的多肽研究中心，以期在這一重要領(lǐng)域中取得突破性進展?，F(xiàn)在具有生物活性的多肽已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在臨床檢測、醫(yī)學(xué)研究、疾病防治和治療等三大方面。
1，多肽合成的原理與步驟
多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法*的優(yōu)點，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。
1.1多肽合成基本原理：
先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合→洗滌→去保護→中和及洗滌→下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，zui后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護的稱為FMOC固相合成法。
1.2固相多肽合成的步驟：
A，樹脂的選擇及氨基酸的固定
用于多肽合成的高分子的載體主要有3類：交聯(lián)聚苯乙烯；聚酰胺：聚乙烯一乙二醇脂類樹脂。氨基酸的固定主要是通過保護的氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團之間形成共價鍵來實現(xiàn)。
B，氨基、羧基、側(cè)鏈的保護及脫除
要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基團也要保護，反應(yīng)完成后再將保護基團除去，近年來，F(xiàn)MOC合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法。
C，成肽反應(yīng)
固相中的成肽反應(yīng)一般是將兩個相應(yīng)的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的縮合劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。
D，裂解及合成肽鏈的純化
BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被采用。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。
2.固相多肽合成的應(yīng)用——多肽合成儀
多肽固相合成技術(shù)的發(fā)明同時促進了多肽合成的自動化。世界上*臺真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1980年代初期，它是利用氮氣鼓泡來對反應(yīng)物進行攪拌，用計算機程序控制來實現(xiàn)有限度的自動合成。雖然在各項功能方面有著明顯的缺陷，但是它畢竟把人從實驗室里解放出來，很大地提高了工作效率。
隨著多肽科學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家也對合成儀提出了更高的要求，從而帶動了合成儀的發(fā)展。目前多肽合成儀品種繁多。從合成量上分，可分為微克級的，毫克級的，克級的和公斤級的；從功能上分，可分為研究型的，小試型的，中試型的，普通生產(chǎn)型的和GMP生產(chǎn)型的；從自動化程度上分，可分為全自動的，半自動的和手動的；從通道上分，可分為單通道的和多通道的；從技術(shù)角度上分，可分為*代的，第二代的，和第三代的；等等。
*代多肽合成儀標志性特點是采用氮氣鼓泡的攪拌原理來對反應(yīng)物進行攪拌，即合成儀上反應(yīng)器是固定的，氮氣從反應(yīng)器的下方通過反應(yīng)器到上部排出，在這一過程中產(chǎn)生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設(shè)計的好處是結(jié)構(gòu)簡單，成本低，但各項功能方面有著明顯的缺陷，目前采用氮氣鼓泡方式的*代多肽合成儀已大部分退出了市場。
第二代多肽合成儀標志性特點是用不*性的機械攪拌來取代氮氣鼓泡，一般可分為接觸式攪拌與非接觸式攪拌兩種。
接觸式攪拌常見的攪拌方式是伸入反應(yīng)器內(nèi)部的螺旋槳由上部的電機帶動進行快速旋轉(zhuǎn)，使反應(yīng)器內(nèi)部的固液兩相進行混合。但攪拌方式帶來的不利因素如清洗障礙，合成量低，反應(yīng)死角等也不容忽視，目前*共大多數(shù)多肽合成儀生產(chǎn)廠商放棄了接觸式攪拌方法。
機械性非接觸式攪拌的主要原理是反應(yīng)器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。這種由反應(yīng)器本身的運動而帶動里面固液兩相混合的方法克服了接觸式攪拌帶來的缺點，合成產(chǎn)量和純度也明顯好于用氮氣鼓泡的*代合成儀。所以機械性非接觸式攪拌成為了多肽合成儀的主流。但是由于這種攪拌方法不能真正消除反應(yīng)死角，所以科學(xué)家們并沒有滿足而停下他們追求的腳步。
第三代多肽合成儀其反應(yīng)器轉(zhuǎn)動方式有別于前兩代的多肽合成儀，即反應(yīng)器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉(zhuǎn)，帶動反應(yīng)器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應(yīng)器的zui上方，真正做到了*。*多肽合成儀的另一種方式是反應(yīng)器在數(shù)控馬達的帶動下作上下180度的翻轉(zhuǎn)運動。固相和液相在運動過程中不斷從反應(yīng)器的一端到達另一端再返回來。一般用這種儀器合成出來的肽純度是zui高的，且適合于擴大生產(chǎn)。
<<抗血清的制備
1，多肽合成的原理與步驟
多肽合成是一個重復(fù)添加氨基酸的過程，固相合成順序一般從C端（羧基端）向 N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發(fā)展成功了固相多肽合成方法以來，經(jīng)過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質(zhì)合成中的一個常用技術(shù)，表現(xiàn)出了經(jīng)典液相合成法*的優(yōu)點，從而大大的減輕了每步產(chǎn)品提純的難度。
1.1多肽合成基本原理：
先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應(yīng)，接長肽鏈。重復(fù)（縮合→洗滌→去保護→中和及洗滌→下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，zui后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護的稱為BOC固相合成法，α-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護的稱為FMOC固相合成法。
1.2固相多肽合成的步驟：
A，樹脂的選擇及氨基酸的固定
用于多肽合成的高分子的載體主要有3類：交聯(lián)聚苯乙烯；聚酰胺：聚乙烯一乙二醇脂類樹脂。氨基酸的固定主要是通過保護的氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團之間形成共價鍵來實現(xiàn)。
B，氨基、羧基、側(cè)鏈的保護及脫除
要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側(cè)鏈上的活性基團也要保護，反應(yīng)完成后再將保護基團除去，近年來，F(xiàn)MOC合成法得到了廣泛的應(yīng)用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法。
C，成肽反應(yīng)
固相中的成肽反應(yīng)一般是將兩個相應(yīng)的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內(nèi)并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經(jīng)常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的縮合劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。
D，裂解及合成肽鏈的純化
BOC法用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護基，F(xiàn)MOC法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被采用。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。
2.固相多肽合成的應(yīng)用——多肽合成儀
多肽固相合成技術(shù)的發(fā)明同時促進了多肽合成的自動化。世界上*臺真正意義上的多肽合成儀出現(xiàn)在1980年代初期，它是利用氮氣鼓泡來對反應(yīng)物進行攪拌，用計算機程序控制來實現(xiàn)有限度的自動合成。雖然在各項功能方面有著明顯的缺陷，但是它畢竟把人從實驗室里解放出來，很大地提高了工作效率。
隨著多肽科學(xué)的發(fā)展，科學(xué)家也對合成儀提出了更高的要求，從而帶動了合成儀的發(fā)展。目前多肽合成儀品種繁多。從合成量上分，可分為微克級的，毫克級的，克級的和公斤級的；從功能上分，可分為研究型的，小試型的，中試型的，普通生產(chǎn)型的和GMP生產(chǎn)型的；從自動化程度上分，可分為全自動的，半自動的和手動的；從通道上分，可分為單通道的和多通道的；從技術(shù)角度上分，可分為*代的，第二代的，和第三代的；等等。
*代多肽合成儀標志性特點是采用氮氣鼓泡的攪拌原理來對反應(yīng)物進行攪拌，即合成儀上反應(yīng)器是固定的，氮氣從反應(yīng)器的下方通過反應(yīng)器到上部排出，在這一過程中產(chǎn)生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設(shè)計的好處是結(jié)構(gòu)簡單，成本低，但各項功能方面有著明顯的缺陷，目前采用氮氣鼓泡方式的*代多肽合成儀已大部分退出了市場。
第二代多肽合成儀標志性特點是用不*性的機械攪拌來取代氮氣鼓泡，一般可分為接觸式攪拌與非接觸式攪拌兩種。
接觸式攪拌常見的攪拌方式是伸入反應(yīng)器內(nèi)部的螺旋槳由上部的電機帶動進行快速旋轉(zhuǎn)，使反應(yīng)器內(nèi)部的固液兩相進行混合。但攪拌方式帶來的不利因素如清洗障礙，合成量低，反應(yīng)死角等也不容忽視，目前*共大多數(shù)多肽合成儀生產(chǎn)廠商放棄了接觸式攪拌方法。
機械性非接觸式攪拌的主要原理是反應(yīng)器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。這種由反應(yīng)器本身的運動而帶動里面固液兩相混合的方法克服了接觸式攪拌帶來的缺點，合成產(chǎn)量和純度也明顯好于用氮氣鼓泡的*代合成儀。所以機械性非接觸式攪拌成為了多肽合成儀的主流。但是由于這種攪拌方法不能真正消除反應(yīng)死角，所以科學(xué)家們并沒有滿足而停下他們追求的腳步。
第三代多肽合成儀其反應(yīng)器轉(zhuǎn)動方式有別于前兩代的多肽合成儀，即反應(yīng)器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉(zhuǎn)，帶動反應(yīng)器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應(yīng)器的zui上方，真正做到了*。*多肽合成儀的另一種方式是反應(yīng)器在數(shù)控馬達的帶動下作上下180度的翻轉(zhuǎn)運動。固相和液相在運動過程中不斷從反應(yīng)器的一端到達另一端再返回來。一般用這種儀器合成出來的肽純度是zui高的，且適合于擴大生產(chǎn)。
<<抗血清的制備
