關(guān)于酶聯(lián)免疫試劑盒試劑的性質(zhì)
(一) 基本原理 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無(wú)色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過(guò)底物的顏色反應(yīng)來(lái)判定有無(wú)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過(guò)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來(lái)，使ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。
(二) 用于標(biāo)記的酶 用于標(biāo)記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩(wěn)定；反應(yīng)產(chǎn)物易于顯現(xiàn)；能商品化生產(chǎn)。目前應(yīng)用較多的有辣根過(guò)氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應(yīng)用zui廣。
1.辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 過(guò)氧化物酶廣泛分布于植物中，辣根中含量zui高，從辣根中提取的稱(chēng)辣根過(guò)氧化物酶（HRP），是由無(wú)色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)氨基酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應(yīng)的zui適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的zui大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，zui高為3.4。RZ在0.6以下的酶制品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用于標(biāo)記。RZ在2.5以上者方可用于標(biāo)記。HRP的作用底物為過(guò)氧化氫，催化反應(yīng)時(shí)的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產(chǎn)物為橙色，可溶性，敏感性高，zui大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應(yīng)，顏色可在數(shù)小時(shí)內(nèi)不改變,是目前國(guó)內(nèi)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)中zui常用的一種；（2）聯(lián)大茴香胺（OD）,產(chǎn)物為橘，zui大吸收值在400nm，顏色較穩(wěn)定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產(chǎn)物為深棕色，zui大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯(lián)甲苯胺（OT）產(chǎn)物為藍(lán)色，zui大吸收值在630nm，部分溶解，不穩(wěn)定，不耐酸，但反應(yīng)快，顏色明顯。
2.堿性磷酸酶 系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個(gè)同功酶組成。它們的底物種類(lèi)很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價(jià)無(wú)毒性。酶解產(chǎn)物呈，可溶，zui大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應(yīng)系統(tǒng)中，37℃1分鐘水解1μg磷酸苯二鈉為一個(gè)單位。
(三) 抗體的酶標(biāo)記方法及標(biāo)記效果測(cè)定
1.標(biāo)記方法 良好的酶結(jié)合物取決于兩個(gè)條件：即價(jià)的抗體和高活性的酶?？贵w的活性和純度對(duì)制備標(biāo)記抗體至關(guān)重要，因?yàn)樘禺愋悦庖叻磻?yīng)隨抗體活性和純度的增加而增強(qiáng)。在酶標(biāo)記過(guò)程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價(jià)高及抗原親和力強(qiáng)的抗體球蛋白，使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯(lián)，常用戊二醛法和過(guò)碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標(biāo)記抗體的改良過(guò)碘酸鈉法簡(jiǎn)單易行，標(biāo)記效果好，特別適用于實(shí)驗(yàn)室的小批量制備。其標(biāo)記程序?yàn)椋簩?μg HRP溶于0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配制的0.06 mol/L的過(guò)碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鐘 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鐘后加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻并裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液于4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時(shí)使之結(jié)合，然后吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時(shí)，將上述結(jié)合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鐘后離心，將所得沉淀物溶于少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，并對(duì)之透析（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標(biāo)抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進(jìn)行測(cè)定后，冷凍干燥或低溫保存。
2.酶標(biāo)抗體標(biāo)記效果測(cè)定：測(cè)定內(nèi)容包括酶和抗體活性、結(jié)合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結(jié)合率。
(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴(kuò)散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉淀線，經(jīng)PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時(shí)，將瓊脂凝膠片浸于酶底物溶液中著色，如果出現(xiàn)應(yīng)有的顏色反應(yīng)，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結(jié)合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結(jié)合物在顯色后，瓊擴(kuò)滴度應(yīng)在1:16以上。另一個(gè)測(cè)定方法是用系列稀釋的酶標(biāo)抗體直接以ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)方法進(jìn)行方陣滴定，此法不僅可以測(cè)定標(biāo)記效果，還可以確定酶標(biāo)抗體的使用濃度。
(2) 結(jié)合物的定量測(cè)定 一般是對(duì)結(jié)合物中的酶和IgG進(jìn)行定量測(cè)定。常用紫外分光光度計(jì)于403nm和280nm進(jìn)行測(cè)定，然后按下列公式計(jì)算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對(duì)于過(guò)碘酸鈉氧化法制備的標(biāo)記抗體量，按下列公式計(jì)算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可計(jì)算出標(biāo)記抗體的摩爾（mol）比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結(jié)合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結(jié)合物溶液量
結(jié)合物產(chǎn)率=結(jié)合物中酶總量/標(biāo)記時(shí)加入的酶量×100%
用于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)的結(jié)合物的酶量為400(g/ml時(shí)效果一般，為500(g/ml時(shí)效果較好，達(dá) 1000(g/ml時(shí)效果。mol.比值由于結(jié)合物中含的IgG并不*可靠，所以不能作為主要參數(shù)。一般認(rèn)為mol.比值為0.7時(shí)效果一般，1.0時(shí)效果較好，1.5-2.0時(shí)。酶結(jié)合率為 7%時(shí)效果一般，為9%－10%較好，達(dá)30%以上時(shí)。(四) ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn),酶聯(lián)免疫試劑盒)方法的基本類(lèi)型、用途及操作程序