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ELISA試劑盒試劑配制研究方法

2014-08-09 [1003]

ELISA試劑盒以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體,反應后用磁鐵的吸引進行分離,洗滌利便,一般均配以特殊儀器。為比較不同固相在某一ELISA測定中的優(yōu)劣,可應用如下的試驗:用其他免疫學測定方法選出一個典型的陽性標本和陰性標本,將它們進行一系列稀釋后,在不同的固相載體上按預定的ELISA操縱步驟進行測定,然后比較結(jié)果。
ELISA試劑盒載體的外形主要有三種:微量滴定板、小珠和小試管。良好的ELISA板應該是吸附機能好,空缺值低,孔底透明度高,ELISA試劑盒各板之間、統(tǒng)一板各孔之間、統(tǒng)一板各孔之間機能相近。再者,球型小珠的表面弧度更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點的暴露面處于*反應狀態(tài),因此珠式ELISA的反應往往更為敏捷。IgG對聚苯乙烯等固相具有較強的吸附力,其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上,抗體結(jié)合點暴露于外,因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。
酶聯(lián)免疫試劑盒操作步驟:

1.取出酶標板,設空白孔,依照次序?qū)謩e加入100μl的標準品于空白微孔中。
2.分別標記樣品編號,加入100μl的稀釋樣品于空白微孔中。
3.將酶標板置于37℃溫育30分鐘。
4.將酶標板板取出,將其中的液體甩去,每個孔中全部加滿應用洗滌液后,立即甩去液體。
5.每個孔中加滿應用洗滌液后,輕微振搖酶標板30秒后將孔中的應用洗滌液甩去,在吸水紙上將酶標板拍干。
6.重復第5個步驟5次,在吸水紙上將酶標板拍干。
ELISA試劑盒中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:
1.固相載體的選擇:許多物質(zhì)可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板

2.包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。
3.酶標記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定。
4.酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應,而本身無色。

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